Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Хромогенный субстрат фактора Xa. Специфический хромогенный субстрат для фактора Ха, например: ^а-бензилоксикарбонил^-аргинил^-глицил^-аргинина 4-нитроанилида дигидрохлорид, ^бензоил^-изолейцил^-глутамил-глицил^-
аргинина 4-нитроанилида гидрохлорид, метансульфонил^-лейцил-глицил-L-аргинина 4-нитроанилид, метоксикарбонил^-циклогексилаланил-глицил^-аргинина 4-нитроанилида ацетат. Восстанавливают в соответствии с инструкциями изготовителя.
Буфер для разведений. Раствор, содержащий 3,7 г/л трис-(гидроксиметил)-аминометана R, 2,1 г/л имидазола R, 0,02 г/л гексадиметрина бромида R и 1 г/л бычьего альбумина R или человеческого альбумина R. При необходимости доводят значение рН до 8,4 с использованием хлористоводородной кислоты R.
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Испытуемый раствор. Испытуемый препарат разбавляют буфером для разведений, получая раствор с содержанием 0,18 МЕ фактора Х в миллилитре. Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.
Раствор сравнения. Препарат сравнения разбавляют буфером для разведений, получая раствор с содержанием 0,18 МЕ фактора Х в миллилитре. Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.
Все растворы перед испытанием быстро нагревают на водяной бане до 370С.
Нижеописанные условия определения относятся к титрационным микропланшетам. Если определение производят в пробирках, объемы могут изменяться при условии неизменности соотношений компонентов в смесях.
Определение выполняют с использованием титрационного микропланшета, поддерживаемого при 370С. По 12,5 мкл каждого из разведений испытуемого раствора или раствора сравнения вносят в каждый из рядов ячеек. К содержимому каждой ячейки добавляют 25 мкл RVV и инкубируют в точности 90 секунд. К содержимому каждой ячейки добавляют 150 мкл хромогенного субстрата фактора Ха, разбавленного в соотношении 1:6 буфером для разведений.
Регистрируют скорость изменения оптической плотности (2.2.25) при длине волны 405 нм непрерывно в течение 3 минут и получают среднюю скорость
изменения оптической плотности (ДА/мин). При невозможности непрерывной регистрации, оптическую плотность при 405 нм регистрируют с подходящими последовательными интервалами, например, продолжительностью 40 секунд, строят на миллиметровой бумаге график зависимости оптической плотности от времени и вычисляют из уклона полученной прямой значение ДА/мин. Из значений ДА/мин для каждого разведения испытуемого препарата и препарата сравнения вычисляют активность испытуемого препарата и проверяют достоверность определения с использованием обычных статистических методов (5.3).
2.7.20. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПОЛИОМИЕЛИТА IN VIVO
Способность вакцины вызывать образование нейтрализующих антител определяют in vivo по одному из следующих методов.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЦЫПЛЯТ ИЛИ МОРСКИХ СВИНОК
Готовят подходящий ряд, состоящий не менее чем из трех разведений испытуемой вакцины с использованием подходящего буферизированного раствора хлорида натрия. Морских свинок массой тела 250-350 г или цыплят возрастом 3 недели распределяют по группам, состоящим из 10 особей, и назначают каждой из групп одно из разведений вакцины. Каждому животному внутримышечно вводят по
0,5 мл разведения, которое было назначено группе, к которой данное животное относится. Через 5-6 дней проводят забор крови и отделяют сыворотки. Определяют наличие в разведениях сывороток (1:4) нейтрализующих антител к каждому из человеческих полиовирусов: 1, 2 и 3. 100 CCID50 вируса смешивают с разведением сыворотки и инкубируют при 370С в течение 4,5-6 часов. Хранят при 5±30С в течение 12-18 часов. Смеси прививают клеточным культурам для определения присутствия вирусов, не подвергшихся нейтрализации, и ведут регистрацию результатов в течение периода до 7 дней после инокуляции. Для каждой группы животных отмечают количество сывороток, в которых обнаружено наличие нейтрализующих антител, и вычисляют разведение вакцины, дающее такой отклик у 50% животных. Параллельно выполняют контрольный опыт с использованием подходящего препарата сравнения. Вакцина выдерживает испытание, если обнаруживается наличие нейтрализующих антител к каждому из трех типов вируса у 50% животных в разведении вакцины в соотношении 1:100 или более.
ИСПЫТАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРЫС.
Метод количественного определения in vivo состоит из внутримышечного введения в задние конечности не менее трех разведений испытуемой вакцины и вакцины сравнения с использованием для каждого разведения группы из 10 крыс подходящей линии, не содержащих патогенов. Для получения достоверных результатов для всех серотипов часто бывает необходимо использовать четыре разведения. Количество животных в группе должно быть достаточным для получения результатов, отвечающих критериям достоверности; десяти крыс в группе обычно достаточно, хотя достоверные результаты могут быть получены и с меньшим числом животных в группе. Масса тела животного не должна отличаться более, чем на 10% от средней по группе. Каждой крысе вводят по 0,5 мл материала. Диапазон доз выбирают таким образом, чтобы получить дозовый отклик для всех трех типов полиовируса. Забор крови у животных производят через 20-22 дня.
